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細胞污染詳解
發(fā)布日期: 2023/4/6 10:19:11

細胞作為生命活動的基本單位,也是咱們生命科學及醫(yī)學領(lǐng)域最重要的實驗材料之一。

學會正確地進行細胞培養(yǎng)是細胞實驗的基礎(chǔ),養(yǎng)好細胞是很多實驗成功的關(guān)鍵。

然而,對于養(yǎng)細胞的人來說,真的是不想看到細胞的污染。

細胞的污染將直接導致實驗材料的不純凈,造成數(shù)據(jù)的錯誤,及后續(xù)實驗結(jié)果的不可靠。

因此,細胞的污染一旦出現(xiàn),往往代表著實驗按下暫停鍵,又要重復(fù)進行前面的細胞獲取和培養(yǎng)實驗,很可能幾個月的埋頭苦干就此白費。

細胞培養(yǎng)中的常見污染

細胞污染是一個很廣的范圍,微生物的種類更是各種各樣,不同的污染的原因不同處理也不同,因此掌握對常見細胞污染的識別至關(guān)重要。

細胞培養(yǎng)中常見的生物污染類型有細菌污染、支原體污染、黑膠蟲污染、真菌污染、病毒污染以及交叉污染等污染。

每一種污染都有各自的特點。如細菌和霉菌增殖迅速,短時間就對細胞造成明顯傷害;而支原體和病毒對細胞的影響則是一種緩慢長期的過程。

污染的預(yù)防

微生物污染在細胞培養(yǎng)中是非常常見的,也是令人頭大的一件事情。而預(yù)防是防止細胞培養(yǎng)過程中發(fā)生污染的最好辦法。只有預(yù)防工作做在前,才能將發(fā)生污染的可能性降到最小程度。

根據(jù)統(tǒng)計培養(yǎng)細胞產(chǎn)生的污染源,常常來自于不潔的環(huán)境和不規(guī)范的實驗操作,比如受污染的培養(yǎng)基、試劑或儀器。因此,一般預(yù)防可從以下幾方面著手:

(1)在培養(yǎng)液中添加抗生素。

可以在培養(yǎng)基中事先加入雙抗(硫酸鏈霉素和氨芐青霉素)。但雙抗有時會影響細胞的狀態(tài),所以在做轉(zhuǎn)染、檢測細胞某項指標前一定要撤去雙抗,以避免影響實驗結(jié)果。

(2)從消毒滅菌著手

①細胞培養(yǎng)所用物品清洗、消毒要徹底,各種溶液滅菌除菌要仔細,并在無菌試驗陰性后才能使用。

玻璃吸管和玻璃培養(yǎng)瓶的消毒:1)高壓蒸汽滅菌15分鐘以上;2)干烤消毒140℃ 2小時以上。

培養(yǎng)基(pH7.2)和血清配制好后要做無菌試驗:將血清按10%加入培養(yǎng)基內(nèi),用無菌的玻璃離心管或玻璃瓶取完全培養(yǎng)基5-10ml置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2-3天,肉眼見無渾濁或沉淀等異物。分裝后置4℃保存。

消化液(pH7.8)或其它加入液,應(yīng)用高壓蒸汽滅菌或一次性無菌濾器過濾除菌,分裝成置-20℃保存。

②操作室及剩余的無菌器材要定期清潔消毒滅菌。

定期清洗或更換超凈臺過濾膜、預(yù)濾網(wǎng)。

CO2培養(yǎng)箱的清潔是較易被忽視的地方,應(yīng)1-2個月對培養(yǎng)箱定期進行清潔消毒。先用75%酒精擦拭培養(yǎng)箱內(nèi)壁、隔板、水盤2-3次,用雙蒸水清洗,再用酒精棉球擦拭一遍,最后紫外燈照射1h以上或進行高溫高壓滅菌處理。水盤內(nèi)加入無菌水(應(yīng)每周更換),待培養(yǎng)箱內(nèi)溫度、濕度、CO2濃度穩(wěn)定后再放入細胞。

在細胞間內(nèi)準備專用的儀器如離心機,移液器,水浴鍋等,并定期進行消毒,減少細胞污染的可能性。

③實驗環(huán)境的徹底消毒

甲醛熏蒸法:甲醛是一種廣譜滅菌劑,其水溶液和氣體對各種細菌、芽孢及真菌等微生物均有殺滅作用。

實驗環(huán)境紫外照射 15~30 min 滅菌

(3)規(guī)劃實驗操作

雖然,養(yǎng)細胞的步驟很簡單無非是換液、傳代、凍存、復(fù)蘇。但是具體有好多小細節(jié)需要注意....

進入實驗室環(huán)境時,佩戴好口罩及手套,穿上潔凈實驗服,避免灰塵或唾液進入培養(yǎng)物中。

超凈臺用紫外燈照射30-60min,并開啟超凈臺風機運轉(zhuǎn)5-10min,然后用75%酒精球擦拭超凈臺臺面,再開始實驗操作。

進入超凈臺前應(yīng)用75%酒精對雙手及手腕進行全面擦拭,確保除菌完全。

實驗用品用75%酒精擦拭后才能放入超凈臺內(nèi)。生物安全柜和超凈工作臺里的東西能少盡少。東西過多會干擾氣流,反而更不安全,并且在物品的擺放要有一定的順序分區(qū)要規(guī)劃好。這樣細胞在生物安全柜或者超凈臺才能安全。

操作動作要輕,必須在火焰周圍無菌區(qū)內(nèi)打開瓶口,并將瓶口轉(zhuǎn)動燒灼。操作時盡量不要說話,若打噴嚏或咳嗽應(yīng)轉(zhuǎn)向背面。

操作時小心取用無菌物品,應(yīng)避免污染。勿碰觸吸管尖頭,不小心碰觸后應(yīng)立即更換;手及物品不要在暴露的瓶口上方來往,容器打開后,傾斜45度操作,操作完成后及時蓋上瓶蓋。

操作時要常更換吸管,一旦發(fā)現(xiàn)吸管口接觸了手和其他污染物品應(yīng)棄去。實驗完畢用消毒水浸泡的紗布擦臺面。

實驗用品用完應(yīng)移出超凈臺,以利于空氣流通。

實驗完成后用75%酒精擦拭超凈臺臺面。

(4)防止細胞交叉污染

在進行多種細胞培養(yǎng)操作時,所用器具要嚴格區(qū)分,即使不同細胞使用相同的培養(yǎng)基也不要共享同一瓶培養(yǎng)基,避免細胞間的交叉污染。

每次操作最好只處理一種細胞,多種細胞多種操作一起進行時易發(fā)生不同細胞間的污染;

在進行換液或傳代操作時,注射器和滴管不要觸及細胞培養(yǎng)瓶瓶口,以免把細胞帶到培養(yǎng)液中污染其他細胞。

(5)所有新購入或接入的細胞,必須及時保種凍存,一旦發(fā)生污染可重新復(fù)蘇細胞,繼續(xù)培養(yǎng),這是抵御污染最直接有效的辦法。

養(yǎng)好細胞的方法就一種,就是細心,在操作上下功夫

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